Флуориметр для лаборатории

Определение люминесценции; время жизни.
Излучение, избыточное над тепловым, длительность которого намного превышает период световых колебаний, называется люминесценцией. По длительности излучения люминесценция делится на флуоресценцию (время жизни 10^-8 - 10^-9 с) и фосфоресценцию (время жизни 10^-6 с и более).

Характеристиками люминесценции являются среднее время жизни, спектры возбуждения и излучения, квантовый и энергетический выходы и поляризация.
Время жизни флуоресценции измеряется либо с помощью фазовой флуорометрии, либо с помощью лазерной пикосекундной техники, а время жизни фосфоресценции — с помощью фосфороскопа.

Спектры возбуждения и излучения флуоресценции; выход флуоресценции; поляризация. Спектром излучения флуоресценции (спектром флуоресценции) называется зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны или частоты при постоянной интенсивности и длине волны возбуждающего света. Спектр флуоресценции описывается зависимостью Iизл=Iизл(λ) при Iв=const, λв=const (или νв=const, где в относится к параметрам возбуждения). Длина волны возбуждающего света расположена в пределах спектра поглощения флуоресцирующего вещества; обычно она выбирается равной λmax, длине волны максимума спектра поглощения. Для регистрации спектра флуоресценции необходимы: источник возбуждающего света, два монохроматора или фильтра (для возбуждения и для анализа спектра), фотоприемники для измерения интенсивности возбуждающего света и интенсивности флуоресценции.

Опытным путем установлено, что форма спектра флуоресценции (или нормированный спектр флуоресценции) не изменяется при изменении длины волны возбуждающего света в пределах полосы поглощения флуоресцирующего вещества. Это утверждение называется законом С.И. Вавилова. Он верен для одного поглощающего или излучающего вещества.

Спектр возбуждения флуоресценции определяет эффективность возбуждающего света разной длины волны в возбуждении флуоресценции. Максимальную интенсивность флуоресценции поддерживают постоянной, изменяя интенсивность возбуждающего света. Тогда спектр возбуждения можно построить, откладывая величину, обратную интенсивности возбуждающего, против соответствующей длины волны.

Важной характеристикой является выход флуоресценции. Различают энергетический и квантовый выходы флуоресценции. Энергетическим выходом флуоресценции называется отношение интенсивности флуоресценции к интенсивности поглощенного света. Квантовым выходом флуоресценции называется отношение числа испущенных квантов флуоресценции к общему числу поглощенных квантов.

Существуют флуоресцирующие вещества с очень большим квантовым выходом. Так, флуоресценция 6-аминоакридина в спирте имеет квантовый выход около 0,9. Это значит, что очень мало поглощенной энергии переходит в тепло; по-видимому, в этом случае мы имеем дело с очень жесткой молекулой.

Весьма важной характеристикой флуоресценции является поляризация. В общем виде поляризация флуоресценции характеризует анизотропию излучающего осциллятора. Она может быть описана двумя величинами: поляризацией и анизотропией флуоресценции.

Свойства спектров флуоресценции: правило Стокса, закон Вавилова, правило зеркальной симметрии В.Л. Левшина. Экспериментальным путем Стокс установил, что спектр флуоресценции в целом сдвинут в сторону длинных волн по сравнению со спектром поглощения. Это происходит из-за диссипации энергии в тепло в возбужденном состоянии молекулы. Спектральная область флуоресценции, расположенная в области длин волн, меньших, чем длинноволновый край полосы поглощения, называется антистоксовой областью. В последние годы с помощью пикосекундной хроноскопии прямо показано, что спектр флуоресценции с течением времени после прекращения возбуждения коротким лазерным импульсом постепенно сдвигается в красную область спектра. С.И. Вавилов экспериментально установил для растворов красителей следующее положение, впоследствии названное законом Вавилова: в пределах полосы поглощения квантовый выход флуоресценции красителя не зависит от длины волны возбуждающего света и является постоянной величиной. Это происходит потому, что за время жизни возбужденного состояния молекула красителя “разменивает” неравновесную, избыточную тепловую энергию до нижнего возбужденного вибронного уровня первого синглетного возбужденного электронного состояния. Постоянство квантового выхода флуоресценции может служить критерием чистоты (однокомпанентности) флуоресцирующего вещества, а также показывает отсутствие химических реакций, которые могут возникнуть под действием возбуждающего света. Для растворов сложных молекул красителей В.Л. Левшиным было установлено правило зеркальной симметрии спектров. Оно состоит в том, что нормированные спектры поглощения и люминесценции, построенные в виде зависимости от частоты или волнового числа, симметричны относительно прямой, проходящей через точку пересечения спектров и перпендикулярной оси абсцисс. Это правило отражает примерно одинаковую колебательную структуру основного и возбужденного состояний молекулы.

Молекулярная спектроскопия

Флуориметрия